什么是NGS

NGS技术是精准医学领域中一项非常关键的技术。精准诊断离不开分子诊断，而NGS技术是其中最难亦是应用最广的一项分子诊断技术。

由于NGS检测具有很高的灵敏度，在NGS检测过程中，样本源性污染、Index源性污染、扩增产物污染以及气溶胶污染均可能导致假阳性或者假阴性的结果。因此，为了保证检测结果的准确性，对高通量测序实验室进行合理有效的分区规划是至关重要的。

NGS实验室的建设要点

1. NGS实验室的面积

在建设NGS实验室时需注意总体面积不宜过大，以免能耗消耗非常大。此外，在实验室各区比例的设置上不要求平均比例，有的环节很小即可，有的环节可相对较大一些，即比例要合适。随着医院对NGS实验室的支持力度越大，要求也越为严格，应设置适当的房间数。

  2.NGS实验室的风向

其一，NGS实验室应使用全新风系统，而不能使用普通家用空调。新风系统可排出污染，而这是防污染最基础的设置。

其二，需注意整个房间的气流方向应形成对流才有效。

其三，目前出现问题较大的是生物安全柜、通风柜和超净工作台这三种设备的合理配置使用。

NGS实验室设计原则

1. 各区独立

   实验室各个区域无论是在物理空间上还是实际使用过程中，都应当处于完全分隔状态，并且各区域之间不能有空气的直接流通。
   

2. 单一流向

   NGS检测通常涉及PCR扩增及核酸纯化富集等过程，任何样本源性污染、分析标签源性污染、扩增产物污染或气溶胶污染均可能导致假阳性或假阴性结果出现，因此各实验区域与缓冲间应有一定的通风压力差，保证合理的空气流向，防止污染。
   

3. 因地制宜

   新建实验室除合理规范外，也要易于管理;若原有实验室通过合理的规划改造也能满足质量管理要求，亦可不必特地新建实验室。
   

4. 便于工作

   实验室区域选择及空间设计还应最大限度考虑是否方便日常监测工作，包括方便人员流动效率、大型仪器设备进出落地等。

NGS实验室布局说明

1. 试剂准备区

   本区应为洁净区域，用于配制试剂、储存试剂及消耗品。若其他区污染通过空气流入该区域内，将影响后续操作流程和最终实验结果，所以需独立成区。此外，该区还需设置正负压缓冲间，避免实验室内外空气流通。后续各区域的缓冲间设置原则同该区一样。
   

2. 标本制备区

   本区为半污染区，用于样本DNA提取及其定量和浓度检测。起始DNA模板的质量和测序结果的准确性紧密相关，需严格遵循防污染要求，避免下游扩增产物对其污染。

若样本为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，还需设置标本制备前区，用于标本切片和HE染色。

  3.打断区

本区为半污染区，用于样本DNA片段化。人类基因组DNA长度过长，而NGS检测的DNA片段范围在200~300bp左右，所以在文库制备前需要进行片段化处理，常用的有超声打断的物理方法。

若空间有限，可在标本制备区专门划分打断区域，但需注意打断后的样本不在该区域开盖转管，以免污染其他DNA模板，同时做到定期清洁打断区。

耗消耗非常大。此外，在实验室各区比例的设置上不要求平均比例，有的环节很小即可，有的环节可相对较大一些，即比例要合适。随着医院对NGS实验室的支持力度越大，要求也越为严格，应设置适当的房间数。

  4.文库制备区

本区为半污染区，用于构建文库。DNA经片段化处理后产生粘性末端，需先修复补平为平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段两端加上接头和标签。若接头或标签出现污染，导致样本间数据错分，检测结果的准确性也无法保证。

当标本量较少，且标签是通过DNA连接酶的非PCR反应加上的，则标本制备区和文库制备区可合并。

 5.扩增一区

本区为半污染区，用于文库的预扩增和纯化。文库扩增涉及PCR过程，产生扩增产物的气溶胶，需独立成区。

 6.杂交捕获区

本区为半污染区，用于捕获目的序列。

 7.扩增二区

本区为半污染区，用于对捕获后的文库进行扩增，同时对终文库的浓度和片段大小进行检测以及测序文库的pooling工作。

8.测序区

本区为半污染区，用于文库上机测序。房间温度控制在18~22℃，2小时温度波动应小于2℃；湿度保持在20%~60%；避免人为引起的震动。

9.电泳区

本区为半污染区，用于检测提取后的DNA和超声打断后的DNA片段分析。

规划好各功能区后，还需配备相应的仪器设备，同时做上明确标记，避免不同区域间的设备发生混淆，造成交叉污染。

NGS实验室设计总结

NGS实验室规范化布局的根本目的是为了提供物理上的阻隔，防止各区域间的交叉污染。在实际工作中，设计实验室需要依据实际情况“量体裁衣”，以保障检测结果的准确性。